１．使用目的

２．キットの保存と使用期限

３．イントロダクション

４．測定原理

５．注意事項

６．技術上のヒント

７．構成品

８．添付されていないが必要な器具

９．試薬の調製

１０．検体の調製

１１．測定操作法

１２．計算

１３．キットの性能

１４．参考文献

１５．トラブルシューティングとQ&A

測定操作概要

ワークシート

レビス リウマチ因子IgG 型-マウス ELISA KIT はマウスIgG 型リウマチ因子(IgG-RF)抗体価を測定するためのサンドイッチ酵素免疫測定法です。このキットは研究のみにご使用下さい。

特長

●全反応時間は4 時間20 分です。

●マウス血清または血漿中のIgG 型リウマチ因子抗体価を測定します。

●微量な検体（標準操作法は5μl）で測定可能です。

●1 キットは96 ウエルです。

●標準品はマウス由来のものです。

●すべての試薬は溶液タイプです。

●本キットはELISA 法の研修を終了した方、または指導者の下でご使用下さい。
用手法操作で測定する際にはピペッティング操作の再現性が安定した方がご使用下さい。

●準備並びに本キット操作中は手袋、眼鏡、保護用着衣を身につけて下さい。

●試薬類を皮膚に付けないで下さい。本キットの試薬が誤って、目、口、傷口、皮膚等に付着した場合は直ちに水道水で充分に洗い流す等の応急処置を行い、必要な場合は医師の手当てを受けて下さい。

●本キットを使用している場所では飲食や喫煙をしないで下さい。

●本キットは動物由来の成分を含んでいます。測定検体と同様、感染の危険性があるものとして充分注意して取り扱って下さい。

●加熱非動化した検体は、使用しないで下さい。

●試薬類は口でピペッティングしないで下さい。

●ロット番号の違うものとは混ぜて使わないで下さい。

●各ステップでの静置反応時には、ウエルの乾燥、異物の混入、分注試薬の蒸発を防止する為、必ずプレートカバーを被せて下さい。

●ELISA法は測定環境により影響を受けます。測定操作、静置反応場所の室温：20〜25℃（実験台上またはインキュベータ内温度）を厳守して下さい。また、風速（エアコン風も含む）：0.4m/sec*以上、湿度30%未満の環境下での測定は避けて下さい。
*風速0.4m/secの目安は当ホームページ内：ELISA技術情報をご参照下さい。

なぜデング熱は、ブレーク骨熱と呼ばれ

●検体と試薬に不純物が混ざらないように気をつけて下さい。１ウエル/1チップのご使用をお薦めします。

●発色液は96 ウエルプレートに使用するまではほぼ無色または澄明です。光を避けて保存して下さい。

●反応停止液は96 ウエルプレートに使用するまでは無色です。反応停止液をウエルに入れるとすぐに青から黄色に変わります。

●やむを得ず、測定操作を、風速：0.4m/sec以上、湿度30%未満の環境下で実施する場合には、各ステップの静置反応時、プレートカバーをすることに加え、各ウエルの密閉度を上げる措置を講じて下さい。
例）パラフィルムでウエルを覆い、その上にプレートカバーを被せる、またはインキュベータ内、発砲スチロール製箱内で静置反応させる等。測定室の環境条件により対策方法が異なる場合がありますので、詳細を当ホームページ内：ELISA技術情報でご確認下さい（ご不明な際にはお問い合わせ下さい）。

●使用済みの検体、使用した消耗品等は1%ホルマリン、2%グルタールアルデヒドまたは0.1%以上の次亜塩素酸ナトリウム溶液に1 時間以上浸けて下さい。またはオートクレーブ滅菌処理して廃棄して下さい。また、使用した消耗品や未使用の薬品類は所属先施設の規定並びに各地域の法令にしたがって破棄して下さい。

構 成 品	状 態	容 量
(A) 抗原固相化96 ウエルプレート	そのまま使用	96 wells（8×12）/1 枚
(B) 標準溶液（10000mU/ml）※	濃縮液	100μl/1 本
(C) 緩衝液	そのまま使用	60ml/1 本
(D) 標識抗体（ペルオキシダーゼ結合抗体）	濃縮液	20μl/1 本
(E) 発色液（TMB）	そのまま使用	12ml/1 本
(F) 反応停止液（1M H2SO4）※取扱注意	そのまま使用	12ml/1 本
(G) 濃縮洗浄液（10x）	濃縮液	100ml/1 本
プレートカバー		1 枚
取扱説明書		1 部

（※：ロットにより若干、値が異なります。）

●精製水（蒸留水）

●標準溶液希釈用試験管

●洗浄液（希釈用溶液）用ガラス器具（メスシリンダー・瓶）

●チップ交換型ピペット（使い捨てチップで5μl を正確にピペットできるもの、及び50-500μl を正確にピペットできるもの）

●連続分注ピペット（例Eppendorf のmultipette plus）、100μl を連続分注できるもの

●ペーパータオル等の吸水性のあるもの（洗浄後にプレートに残った液を取り除く）

●撹拌器 (Vortex タイプ)

●96 ウエルプレート用シェイカー（約800 rpm）

●96 ウエルプレートリーダー（450 ±10 nm 、620nm:600〜650nm）

●データ分析用ソフトウェア（あれば好ましい）

＊キットの試薬はすべて使用前に必ず室温（20〜25℃）に戻して下さい。
＊測定に必要な分だけ試薬を調製して下さい。（ご不明な際にはお問い合わせ下さい。）
＊キット外箱のラベルに記載されている有効期限の過ぎた試薬は使用しないで下さい。
●室温化後そのまま使用できる試薬類

●濃縮された試薬類

本キットはマウス血清または血漿中の抗リウマチ因子IgG 型抗体価を測定します。加熱非動化した検体は、使用しないで下さい。測定範囲（15.6〜1000mU/ml）に入るよう、キットの緩衝液を用いて検体を希釈して下さい。希釈の目安は、51 倍、101 倍、201 倍です。妨害物質の影響が疑わしい検体は、同一検体において、100 倍以上の希釈で測定して下さい。また、異なる2 ポイント以上の希釈率で希釈直線性を確認して下さい。検体を希釈する場合は、あらかじめ試験管等で緩衝液で希釈し測定ウエルに分注して下さい。濁り及び不溶物のある検体は遠心分離等で除去後測定に用いて下さい。また、溶血した検体や高脂質検体は使わないで下さい。
安定性と保存方法
検体は採取後すぐに測定するか、1 週間以内に測定する場合は2〜8℃で保存して下さい。また、長期に保存する場合は-35℃以下で凍結保管して下さい。凍結した検体は測定する直前に解凍し充分に撹拌して下さい。繰り返しの凍結融解は避けて下さい。正しい結果が得られない原因になります。

「抗原固相化プレートのシールは、プレートが充分に室温に戻ってから剥がして下さい。」

（１） あらかじめ調製した洗浄液を各ウエルに満たし3 回洗浄*します。その後ペーパータオルなどの上でプレートを逆さにし、軽く叩きつけるようにしてウエルに残った液を取り除きます。

（２） 標準（抗体）溶液、または希釈検体を各ウエルに100μl ずつ分注します。

（３） マイクロプレート振とう器などを用いて撹拌**します。

（４） プレートカバーを被せ、室温（20〜25℃）で2 時間静置します。

（５） 反応終了後、反応液を捨て洗浄液を各ウエルに満たし3 回洗浄*します。その後、ペーパータオルなどの上にプレートを逆さにし、軽く叩きつけるようにしてウエルに残った液を取り除きます。

（６） 各ウエルに、ペルオキシダーゼ結合抗体を100μl ずつ分注します。マイクロプレート振とう器などを用いて撹拌**します。

（７） プレートカバーを被せ、室温（20〜25℃）で2 時間静置します。

（８） 反応終了後、反応液を捨て洗浄液を各ウエルに満たし3 回洗浄*します。その後、ペーパータオルなどの上にプレートを逆さにし、軽く叩きつけるようにしてウエルに残った液を取り除きます。

（９） 各ウエルに発色液を100μl ずつ分注します。マイクロプレート振とう器などを用いて撹拌**します。

（10）プレートカバーを被せ、室温（20〜25℃）で20 分間静置します。

（11）各ウエルに反応停止液を100μl ずつ分注し、発色反応を停止します。

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（12）撹拌**後マイクロプレート用分光光度計で450nm（副波長620nm）での吸光度を測定します。
副波長は600〜650nm の範囲で使用できます。

注意

　 ＊手動洗浄についての詳細は当ホームページの「操作法の一例 用手法」並びに「シバヤギELISA キット操作法のてほどき」（Power point）をご参照下さい。
洗浄液の液量目安は300μl/ウエルです。
プレート洗浄機ご使用の場合の圧力目安：5〜25ml/分（ノズルの径により異なります）
洗浄液排出後の乾燥にご注意下さい。

＊＊撹拌の目安：800rpm-10 秒間×3 回

図１：ワークシート（例）

	Strip 1&2	Strip 3&4	Strip 5&6	Strip 7&8	Strip 9&10	Strip 11&12
A	1000mU/ml	ポジコン	検体8	検体16	検体24	検体32
B	500mU/ml	検体1	検体9	検体17	検体25	検体33
C	250mU/ml	検体2	検体10	検体18	検体26	検体34
D	125mU/ml	検体3	検体11	検体29	検体27	検体35
E	62.5mU/ml	検体4	検体12	検体20	検体28	検体36
F	31.3mU/ml	検体5	検体13	検体21	検体29	検体37
G	15.6mU/ml	検体6	検体14	検体22	検体30	検体38
H	0	検体7	検体15	検体23	検体31	検体39

●測定範囲
マウスIgG 型リウマチ因子抗体価を15.6〜1000mU/ml の範囲で測定できます。

●特異性
このELISA 系で使用されている標識抗体はマウスIgG 型リウマチ因子抗体に対して特異的です。マウスIgM との交差性は検出感度以下です。

●精度試験
（１）アッセイ内変動（N=30） 平均C.V.値は6.9%
（２）日差再現性試験（N=30、3 日間） 平均C.V.値は8.7%

＊必ず取扱説明書を一読され詳細について確認後測定操作を行って下さい。

□ウエルプレート、試薬類を充分に室温に戻して下さい。

□濃縮洗浄液の希釈 ：室温化された精製水で、10 倍に希釈して下さい。

□標準溶液の希釈(例）：室温化された緩衝液で、希釈して下さい。

註）＊ひとつ高濃度の標準溶液

□ポジティブ検体の作製、検体の調製。

□	抗原固相化96 ウエルプレート
□	↓洗浄3 回＊
□	希釈検体または標準（抗体）溶液	100μl
□	↓撹拌＊＊、室温、2 時間反応（静置＊＊＊）
□	↓洗浄3 回＊
□	ペルオキシダーゼ結合抗体の希釈 室温化された緩衝液で、2000 倍に希釈して下さい。
□	↓洗浄3 回＊
□	ペルオキシダーゼ結合抗体	100μl
□	↓撹拌＊＊、室温、2 時間反応（静置＊＊＊）
□	↓洗浄3 回＊
□	発色液 （TMB）	100μl
□	↓撹拌＊＊、室温、20 分間反応（静置＊＊＊）
□	反応停止液 （１M H2SO4 ）※取扱注意	100μl
□	↓撹拌＊＊
□	吸光度測定（主波長450nm、副波長 620nm）
室温：20〜25℃

　 ＊プレート洗浄機またはピペットで洗浄液を加える場合の液量目安：300μl/ウエル
プレート洗浄機圧力目安：5〜25ml/分（ノズルの径により異なります）
洗浄液排出後の乾燥にご注意下さい。

＊＊撹拌の目安：800rpm-10 秒間×3 回
副波長は600〜650nm の範囲で設定して下さい。

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A
B
C
D
E
F
G
H

【貯法】 ；2〜8℃、暗所（凍結厳禁）
【有効期限】 ；製造日から6 ヶ月間（使用期限は外箱上蓋のラベル内に表示）
【英語表記】 ；Mouse IgG Rheumatoid Factor ELISA KIT(AKRRG-101,Shibayagi,Gunma,Japan)

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